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豬轉生長因子受體Ⅱ基因克隆與組織表達特徵分析

李琦琦,張久峰,劉紅林,李齊發*
(南京農業大學動物科技學院,江蘇/南京 210095)

  摘要:為了研究豬轉化生長因子受體Ⅱ(transforming growth factor beta receptor Ⅱ, TGFBR2)基因序列特徵和組織表達特徵,利用克隆測序技術獲得二花臉豬TGFBR2基因編碼區序列,採用RT-PCR技術分析二花臉豬TGFBR2基因的組織表達特徵。結果顯示:二花臉豬TGFBR2基因編碼區序列長度為1 461 1hb,編碼蛋白含486個氨基酸殘基,含有eeTbetaR2結構域、蛋白激酶結構域等典型的功能域;RT-PCR發現TGFBR2基因在二花臉豬下丘腦、子宮、卵巢和肌肉等十二種組織中廣泛表達,特別是在卵巢組織中高表達。結果表明:豬TGFBR2基因為進化上相對保守且在卵巢組織中高表達的基因。
  關鍵詞:二花臉豬;TGFBR2;克隆;組織表達

  轉化生長因子b受體Ⅱ(transforming growth factor beta receptorⅡ, TGFBR2)是轉化生長因子b(transforming growth factor beta, TGF-)超家族中的重要一員,也是TGF-信號通路的核心成員(1~2)。與TGF-信號通路其他成員一樣,TGFBR2對哺乳動物機體生命活動甚至疾病發生過程也發揮廣泛的調節作用(2~4)。研究發現,TGFBR2基因在哺乳動物各個組織器官中均有表達,特別是在生殖器官(如卵巢、輸卵管和子宮等)中高表達(5)。在卵巢組織中,TGFBR2在生殖細胞即卵母細胞和體細胞如顆粒細胞(GC)、黃體細胞(TC)和間質細胞(IC)中均有表達(6~7)。TGFBR2在妊娠第十一、十四、十八、廿和廿二周人胚胎卵巢組織中表達,在妊娠中後期卵泡卵母細胞和顆粒細胞中均可檢測到TGFBR2的存在,說明其在胚胎期卵巢發育過程中發揮著非常重要的作用(6)。Yang等(8)研究發現出生後三天小鼠卵巢組織中TGFBR2蛋白表達水平顯著高於出生後五天,與其調控miRAN (miR-145)的表達正好相反,認為TGFBR2對原始卵泡發育啟動和原始卵泡維持具有調控作用。促卵泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)和表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)可促進腔前卵泡顆粒細胞中TGFBR2的表達和細胞增殖(7)。在排卵前卵巢組織中,TGF-BR2蛋白在不同類型的細胞中差異表達,且與黃體標誌酶HSD3B共定位,TGFBR2動力學與黃體化進程密切相關(9)。Ma等(10)研究發現TGFBR2基因Rs3773661位點多態性與卵巢功能早衰有顯著關聯。總之,TGFBR2在哺乳動物卵泡發育的各個階段均發揮至關重要的調控作用。但目前關於豬TGFBR2基因的研究還未見報導。本研究擬以TGFBR2基因為候選基因,採用克隆測序技術獲得高繁殖力豬二花臉豬TGFBR2基因編碼區序列,了解豬TGF-BR2基因、蛋白特徵和組織表達特,徵以期為豬TGFBR2基因功能解析提供參考。

一、材料與方法
 1.試驗動物
  成年二花臉豬母豬(n=6)來自常熟市畜禽良種公司,屠宰後立即採取下丘腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、卵巢、輸卵管、子宮、腹脂和十二指腸等十二個組織的組織樣,置於液氮中凍藏。
 2.總RNA和反轉錄
  豬組織RNA的提取和反轉錄分別採用TRIzol試劑盒(Invitrogen公司)和反轉錄試劑盒(Promega公司)進行,具體方法參見試劑盒說明書。反轉錄產物負卅℃保存備用。
 3.PCR擴增和測序
  利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表一),用於TGFBR2基因編碼區序列的擴增。PCR反應程序為:九十八℃預變性30秒;九十八℃變性10秒,退火30秒,七十二℃延伸二分鐘,共卅二個循環;最後七十二℃總延伸十分鐘,四℃保存。PCR產物經過純化、連接後轉化到DH5α感受態細胞中。挑取陽性克隆,採用試劑盒(Axygen公司)提取質粒,由Invitrogen公司測序。
 4.生物信息學分析
  TGFBR2基因序列、蛋白性質和高級結構等分析參見文獻(11)。人、牛、家犬和小鼠等哺乳動物序列來自GenBank數據庫,序列號分別為NM-001024847.2、NM_001159566.1、XM_534237.3和AF406755.1。
    (詳細內容請參閱2017年5月號現代養豬第66頁)